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qPCR實(shí)驗(yàn)常見問(wèn)題及解決方法

更新時(shí)間:2024-04-01點(diǎn)擊次數(shù):1958
 PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)的簡(jiǎn)稱,是一種選擇性體外快速擴(kuò)增DNA片段的方法。在體外以類似于細(xì)胞內(nèi)DNA的半保留復(fù)制過(guò)程,以擬擴(kuò)增的模板DNA分子,與模板DNA互補(bǔ)的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4dNTP及適合的緩沖體系組成的反應(yīng)體系,經(jīng)過(guò)重復(fù)地變性一退火一延伸三步,擴(kuò)增新的目的DNA鏈,這個(gè)過(guò)程通過(guò)控制反應(yīng)體系的溫度來(lái)實(shí)現(xiàn)??梢栽诙虝r(shí)間內(nèi)將微量的DNA片段擴(kuò)增到足夠數(shù)量,用于后續(xù)的研究和檢測(cè)。下面讓我們一起來(lái)看看qPCR實(shí)驗(yàn)的常見問(wèn)題及解決方法吧!

一、擴(kuò)增曲線不穩(wěn)定

可能原因

RNA純度低;體系中存在較多雜質(zhì);儀器使用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

解決方案

1)提取高純度的RNA,小心操作。

2)對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。

二、擴(kuò)增無(wú)法達(dá)到平臺(tái)期

可能原因

模板濃度太低;循環(huán)數(shù)太少;試劑擴(kuò)增效率低。

解決方案

1) 提高模板量

2) 提高循環(huán)數(shù)

3) 用標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定擴(kuò)增效率,提高鎂離子濃度,換用擴(kuò)增效率高的試劑。

三、熒光下降

可能原因

存在降解;模板濃度過(guò)高。

解決方案

1) 提高體系純度

2) 降低模板量

3) 降低熒光閾值

四、單峰、峰不尖銳

可能原因

與試劑成分有關(guān);或存在大小相近的非特異性擴(kuò)增。

解決方案

1) 溫度跨度不高于7度,視為可用結(jié)果

2) 進(jìn)行高濃度瓊脂糖電泳,確認(rèn)是否為單一條帶。

五、單峰,Tm低于80

可能原因

只有引物二聚體,無(wú)目的條帶;或擴(kuò)增片段過(guò)短。

解決方案

1) 檢查是否加入模板

2) 進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè),確定條帶大小是否正確

六、雙峰,較低峰Tm80度之前

可能原因

由于模板濃度過(guò)低或引物濃度過(guò)高使多余引物形成引物二聚體。

解決方案

1) 適當(dāng)提高退火溫度

2) 提高模板量,降低引物濃度

3) 重新設(shè)計(jì)引物。

七、qPCR注意事項(xiàng)

·提高樣品純度,盡量減少樣品之間的交叉污染。

·每個(gè)樣品至少要做3個(gè)平行孔,以防在 后面的數(shù)據(jù)分析中,由于Ct相差較多或者SD太大,無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

·MasterMix不要反復(fù)凍融,如果經(jīng)常使用,最好融解后放 在4℃;配置體系時(shí)在冰上操作;減少加樣誤差,每管或每孔都要換新槍頭,不要連續(xù)用同一個(gè)槍頭加樣;所有成分加完后,離心去除氣泡。

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