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懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的操作步驟與注意事項(xiàng)有哪些?

更新時(shí)間:2023-10-11點(diǎn)擊次數(shù):2096

懸浮培養(yǎng)指的是一種在受到不斷攪動(dòng)或搖動(dòng)的液體培養(yǎng)基里,培養(yǎng)單細(xì)胞及小細(xì)胞團(tuán)的組織培養(yǎng)系統(tǒng),那么懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的操作步驟與注意事項(xiàng)有哪些呢?讓我們一起來(lái)看看吧!

一、步驟

1. 將準(zhǔn)備好的凍存細(xì)胞放入37℃水浴中解凍。

2. 用70%乙醇對(duì)頂端進(jìn)行消毒,用吸管將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有5mlwan全MEM-10培養(yǎng)基的25cm2組織培養(yǎng)瓶中,輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶,使細(xì)胞均勻分布于培養(yǎng)瓶中,放入5%CO2加濕培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

3. 將培養(yǎng)基吸出,用0.5ml37℃的胰酶/EDTA覆蓋細(xì)胞,消化30~40s。

4. 加入10ml旋轉(zhuǎn)瓶wan全培養(yǎng)基-5,并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至50ml的離心管中。室溫1800g離心5min,棄上清。

5. 將細(xì)胞沉淀懸浮在5ml的旋轉(zhuǎn)瓶wan全培養(yǎng)基-5中,上下吹打,將細(xì)胞團(tuán)打散。

6. 在100ml或200ml通氣旋轉(zhuǎn)瓶中加入50ml旋轉(zhuǎn)瓶wan全培養(yǎng)基-5,并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到瓶中。

7. 取出1ml細(xì)胞懸液,用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。加入適量的旋轉(zhuǎn)瓶wan全培養(yǎng)基-5,使細(xì)胞密度為(3~4)×105細(xì)胞/ml。將細(xì)胞放入無(wú)CO2培養(yǎng)箱,37℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。

8. 隨后的兩天讓細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng),并且每天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),加入適量的旋轉(zhuǎn)瓶wan全培養(yǎng)基-5以維持(3~4)×105細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度。

9. 取1ml的細(xì)胞懸液,用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)細(xì)胞進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

10. 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到(4~5)×105細(xì)胞/ml時(shí),隔天或每天用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至1.5×105或2.5×105細(xì)胞/ml。

11. 分別將裝有50ml或100ml細(xì)胞懸液的100ml或200ml通氣旋轉(zhuǎn)瓶放入37℃無(wú)CO2培養(yǎng)箱旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。每天或隔天傳代。

二、注意事項(xiàng)

由于有些細(xì)胞是不能被養(yǎng)活的,所以需要高的初始密度。

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