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不同動物細胞或組織的蛋白質(zhì)抽提步驟是怎樣的?

更新時間:2023-10-08點擊次數(shù):1291

你知道不同動物細胞或組織的蛋白質(zhì)抽提步驟是怎樣的嗎?讓我們一起來看看吧!

一、培養(yǎng)的貼壁動物細胞的蛋白質(zhì)抽提步驟

1.從貼壁細胞培養(yǎng)瓶中小心傾去培養(yǎng)液。

2.預(yù)冷的 PBS 清洗貼壁的細胞 2 次,小心傾去 PBS。

3.配置含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑(1ml 抽提試劑中加入 5 μl 蛋白酶抑制劑混合液,5 μl PMSF 和 5 μl 磷酸酶混合液)。

4.細胞瓶中加入預(yù)冷的含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑(107 個細胞中加入 1ml 抽提試劑;5×106 個細胞中加入 0.5ml 抽提試劑),輕輕搖動 5 分鐘。

5.用一預(yù)冷的橡膠和塑料細胞刮將培養(yǎng)瓶壁上貼壁細胞刮下來,轉(zhuǎn)移細胞懸浮液到離心管中,冰浴下?lián)u動 15 分鐘進行裂解。

6.裂解液于預(yù)冷的離心機中 14,000xg 離心 15 分鐘。棄去沉淀,上清液立刻轉(zhuǎn)移入新的離心管中保存待用。

二、培養(yǎng)的懸浮動物細胞的蛋白質(zhì)抽提步驟

1.2500xg 離心 10 分鐘沉淀懸浮的細胞,棄去上清液

2.預(yù)冷的 PBS 懸浮沉淀細胞,2500xg 離心 10 分鐘沉淀細胞,去上清。

3.配置含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑(1ml 抽提試劑中加入 5 μl 蛋白酶抑制劑混合液,5 μl PMSF 和 5 μl 磷酸酶混合液)。

4.加入含抑制劑的預(yù)冷蛋白質(zhì)抽提試劑(107 個細胞中加入 1ml 抽提試劑;5×106 個細胞中加入 0.5ml 抽提試劑)。

5.輕輕搖動混和 15 分鐘進行裂解。

6.裂解液于預(yù)冷的離心機中 14,000xg 離心 15 分鐘。棄去沉淀,上清液立刻轉(zhuǎn)移入新的離心管中保存待用。

三、哺乳動物組織的蛋白質(zhì)抽提步驟

1.組織稱重,切小塊放入管中。

2.配置含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑(1ml 抽提試劑中加入 5 μl 蛋白酶抑制劑混合液,5 μl PMSF 和 5ul 磷酸酶混合液)。

3.加入預(yù)冷的含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑(250mg 組織中加入 1ml 抽提試劑)。

4.用勻漿器每次 30 秒低速勻漿,每次勻漿間隔冰浴 1 分鐘,至組織wan全裂解。

5.裂解液于預(yù)冷的離心機中 14,000xg 離心 15 分鐘。上清液立刻轉(zhuǎn)移入新的離心管中保存待用。

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