細胞低溫凍存是培養(yǎng)室常用技術(shù)。那么你知道細胞凍存的原理和實驗步驟嗎？讓我們一起來看看吧！

原理：

將細胞放在-196℃液氮中，可以使細胞暫時脫離生長狀態(tài)，減少細胞代謝，理論上儲存時間幾乎是無限的。最佳的冷凍條件是盡可能地降低細胞內(nèi)的晶體形成，減少細胞內(nèi)水凝固所形成的高濃度溶質(zhì)對細胞造成的低溫損傷。上述要求可通過下列方法獲得：

1.緩慢冷凍，使細胞內(nèi)水分離開細胞，但不可太慢，以避免冰晶形成；

2.用親水的低溫保護劑排除水分；

3.在盡可能低的溫度下保存細胞，降低高濃度鹽對冰中蛋白質(zhì)變性的影響；

4.快速復蘇，減少細胞內(nèi)晶體形成，以及細胞內(nèi)殘余的冰溶解時可溶性成分的產(chǎn)生。

實驗步驟：

1.選擇無支原體污染且對數(shù)生長期的細胞，并且在收獲細胞前 24 小時換一次培養(yǎng)液；

2.按常規(guī)方法將培養(yǎng)的細胞進行胰酶消化，然后 1000rpm 離心 5 分鐘，去上清并收集細胞。然后加入已經(jīng)配置好的凍存液，常用的凍存液是DMSO +wan全細胞生長培養(yǎng)液(20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液)，吸管輕輕吹打，重懸細胞。計數(shù)，調(diào)整至5×106/ml左右；

3.將細胞懸液分裝于無菌凍存管中，每管加1.5m懸液，旋好凍存管并仔細檢查，一定要蓋緊，做好標記；

4.凍存：在液氮容器中，對大多數(shù)細胞來說，每分鐘降 1 至 3 ℃是合適的，通常的操作是把細胞先在-20℃放1-2個小時，再放入 -80℃冰箱過夜，再轉(zhuǎn)入液氮罐，注意下降冷凍速度，過快能影響細胞內(nèi)水分透出，太慢則促進冰晶形成。推薦使用程序降溫盒，操作方便，凍存效果更好。

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